质粒是基因工程的核心载体，高效携带外源基因，是基因与细胞治疗、mRNA疫苗/药物、DNA疫苗、重组蛋白、基因编辑等下游应用的基础。据Grand View Research测算，2024年全球AAV基因治疗药物市场规模约10.2亿美元，预计到2030年将达到27.78亿美元，2025到2030年的CAGR高达18.5%。截至2025年4月10日，国内第一款AAV基因疗法药物获批上市，另外还有40余款AAV基因药物IND临床获批。随着下游细分领域如AAV基因治疗药物、mRNA肿瘤疫苗等的快速发展，对质粒产能、通量、质量、交付效率等提出了更高的要求。

传统质粒DNA生产主要依靠大肠杆菌发酵，面对各技术路线开发周期要求不断提高，该方式已逐渐暴露弊端：

生产周期长：GMP级质粒交付周期通常超过2个月；

工艺复杂：针对不同需求（LVV、AAV、mRNA等）的质粒生产，细胞库构建和发酵纯化工艺验证周期长；

杂质影响的不确定性：抗性基因、宿主蛋白/DNA残留、细菌内毒素残留等存在安全性风险；

稳定性差：在传代培养过程中，发生基因重组概率高；

通量低：依靠发酵培养和层析纯化技术，无法实现通量生产，难以满足早研筛选需求。

生产周期短：2~3天内即可简单快速扩大质粒规模

工艺简单：酶促合成体系简单，易于进行高通量合成

精度高：高保真扩增酶有效避免突变，无细胞内抗性基因干扰及代数扩增突变

Cell-free DNA制备流程

Cell-free DNA制备可分为两个工艺路线：

基于Phi29 DNA聚合酶的滚环复制（RCA）路线：

基于TelN Protelomerase的doggybone DNA（dbDNA）制备路线：

mRNA疫苗在个性化肿瘤疗法领域中的优势明显，各大RNA相关企业纷纷布局肿瘤疫苗管线。个性化癌症疫苗因其量身设计和制造的特性，使其制备的过程中对GMP线性化质粒需求量相对较少，同时需要快速生产。Cell-free DNA合成技术仅在2~3天内就可以快速扩大生产规模，且设备小型，操作简易灵活，成为非常适合个性化mRNA用质粒的生产方式。当使用Cell-free DNA进行mRNA模板制备，mRNA质量是否满足标准要求呢？

近岸蛋白提供快速扩增Super Phi29 DNA聚合酶（目录号：E012）、TelN Protelomerase（目录号：M101）及全套mRNA合成用酶，经验证，使用上述两种Cell-free DNA合成工艺制备的mRNA模板，体外转录得到的mRNA产量、完整性及加帽率等各方面均符合要求。

扩增速度快，3h可完成扩增反应

图例）同时对1ng模板进行扩增，近岸蛋白Super Phi29和N品牌产品在1h时均出现扩增条带，3h完成扩增反应。

酶活高、灵敏度高

利用TelN酶及T5外切酶特性，在质粒中同时设计TelN酶和BsaI酶识别位点：经TelN酶切后成封闭末端的线性双链DNA，不能被T5外切酶消化；再经BsaI切割后，产生新的非封闭末端，从而可以被T5外切酶消化。

RCA+IVT获得符合要求的mRNA

图例）通过RCA获得长链DNA，10ng质粒投入获得约30μg体外转录模板，有效进行模板放大。经限制性内切酶酶切获得IVT模板，体外转录后得到的mRNA产量高，完整性好，且GGG起始模板与Cap1 GAG帽结构进行共转录，加帽率大于95%，总蛋白残留未检出。

 

dbDNA+IVT获得符合要求的mRNA

图例）通过RCA获得长链DNA，10ng质粒投入获得约10-30μg dbDNA，有效进行模板放大。经TelN酶/T5外切酶/限制性内切酶酶切获得IVT模板，体外转录后得到的mRNA产量高，完整性好，且GGG起始模板与Cap1 GAG帽结构进行共转录，加帽率大于95%，总蛋白残留未检出。

 

值得注意的是，dbDNA技术源自英国Touchlight公司开发的专利体系，采用该路径进行DNA生产可能涉及一定的专利费用，但这并不妨碍其技术在实际应用中的巨大潜力。尤其在以质粒为基础的生物疗法领域，如 AAV、LVV载体以及 DNA 疫苗中，dbDNA有望展现出突出的优势。同时，以RCA技术为核心的Cell-free DNA制备，与mRNA药物生产流程相结合，将为个性化肿瘤治疗提供更高效、灵活的候选分子筛选方案，加速药物开发进程。